Evaluate the Role of Adhesion Molecular on Interaction between Neutrophil and Platelet---Study Cyclic Nucleotide Activator on F-Actin Polymerization on Human Neutrophil

由於嗜中性白血球和血小板之交互作用，不論在血栓或發炎過程中都扮演重要地位，因此本研究計畫將以探討增加 cyclic nucleotides 的藥物- YC-1 對嗜中性白血球和血小板的關係為主要方向。我們所要探討的問題：第一、因 YC-1 在全血的實驗中隨著濃度的關係抑制嗜中性白血球和血小板的吸附與凝集（IC50＜20mM），所以我們將分別探討 YC-1 對嗜中性白血球及血小板吸附分子之調控機轉，YC-1 隨著濃度關係抑制 fMLP 所增加 b2-integrin（IC50: 35.6±3.5 mM）的表現，同時我們也發現 YC-1 會調控 fMLP 所引起的嗜中性白血球 F-actinpolymerization（IC50:45.6±4.6mM），而這個抑製作用僅有部份被 ODQ(10mM) 所拮抗，顯示 cGMP 參與在其中，但也顯示 YC-1 仍藉由其他機轉影響 F-actinpolymerization；因此，我們將針對 fMLP 所引起 F-actinpolymerization 之機轉進行探討，目前我們已經確定 PI3K 及鈣離子參與 fMLP 所造成的 F-actin polymerization 現象(Figure 8)，而且和 YC-1 有協同的效果，因此將來我們將釐清 YC-1 對 PI3K/Akt/PKC 以及 cdc42/cAMP 這兩個主要途徑以及鈣離子的關聯。其次則是探討嗜中性白血球 F-actinpolymerization 的現象和 b2-integrin 活性表現以及與血小板之間的吸附情況是否有關。第二個重點是研究 YC-1 對個別細胞的作用以及影響另一個細胞的探討，在我們現有的觀察顯示: 當 YC-1 (10-100 mM) 處理過的嗜中性白血球後，與帶有 fura-2 的血小板混合，在以 fMLP 刺激後無法引起血小板的活化 （血小板細胞內鈣離子增加；fMLP 並不會活化血小板），由於實驗過程中 YC-1 並沒有和血小板接觸，顯示 YC-1 對嗜中性白血球受刺激後的釋放反應有抑製作用（Coughlin 等人在 2000 年已證實嗜中性白血球可藉由釋放cathepsin G 活化血小板），且可能是一種不可逆的反應，這個現象是否可由 YC-1 抑制F-actinpolymerization 之方向來解釋也是我們的研究重點，此外抑制 neutrophil release 是否對嗜中性白血球與血小板凝集作用有影響亦將一併探討。第三，探討血小板 P-selectin 的活化機制是如何受到 YC-1 調控，是藉由增加 cGMP 或是 YC-1 藥物本身的影響仍有許多值得進一步討論的地方? 過程中我們將探討 cGMP 對 P-selectin 之調控機轉，和細胞內 cytoskeleton 的關係如何，這個實驗將配合前述 neutrophil 研究 F-actin polymerization一起進行，由於單純血小板存在下，我們發現 YC-1 抑制 P-selectin 的表現趨近於全血中作用的濃度 (IC50 約15mM 左右)，較接近 YC-1 在全血中之觀察結果。我們希望藉由以上的基礎實驗來探究 YC-1 在血液中如何抑制嗜中性白血球及血小板活化的機制。預期實驗的結果能讓我們更深入瞭解，cGMP 或 YC-1 在血管受傷時對血小板及白血球所產生的相互影響，以及更清楚瞭解嗜中性白血球及血小板細胞骨架的變化對於兩者的生理及病理功能所扮演的角色。

Project ID:PC9308-2062
External Project ID:NSC93-2320-B182-042