Improving Process of L-Tryptophan Fermentation by E. coli

本計畫擬採取傳統菌種改良配合基因重組 技術選育色胺酸高產量菌株,再試圖開發發酵 製程以得到高效率,能利用廉價原料和基因質 體穩定之優良生菌.全程計畫之工作架構分為: (1)大腸菌之變異與篩選以去除色胺酸生合成相 關酵素之調節機能;(2)構築改良後色胺酸生合 成相關基因之質體,並轉殖於大腸菌變異株內, 以期增加色胺酸產量;(3)質體在生長和發酵環 境中穩定性探討;(4)菌體內色胺酸分解途徑之 破壞和(5)色胺酸發酵程序之探討.在第一年(81 年度)中,大腸菌K-12經NTG、UV的突變及經色胺酸 類似物篩選法,從約30,000株中分離出一株有 3.5g/1/24h色胺酸產率之菌株,第二年(82年度)之實 驗證明此突變株之Trp operon中的Anthranilate synthase和Tryptophansynthase基因都被改造,而其回 饋抑制機能有部分被消除.以基因工程技術將 此Trp operon篩選出並構築於pUC18和pSHG576質體中形成pTC701和pTC576.將此質體轉形於原變異株,經 繼代培養發現有同質重組現象.並且有三個Trp operon存在於染色體上.因此,利用這基因重組菌 發酵可產生9g/1/18h之色胺酸,並且不需加抗生素 來穩定Trp operon篩選出並構築於pUC18和pSHG576質 體中形成pTC701和pTC576.將此質體轉形於原變異 株,經繼代培養發現有同質重組現象.並且有三 個Trp operon存在於染色體上.因此,利用這基因重 組菌發酵可產生9g/1/18h之色胺酸,並且不需加抗生素來穩定Trp operon基因.為了再增加此菌的色 胺酸產率,今年度(83年度)的計畫預備進行色胺 酸合成相關基因,AroG(DAHP合成酵素基因)的構築 和轉形以擴大其倍數,增加在菌體內色胺酸生 合成前驅物的量.另一方面,亦將進行色胺酸分 解途徑的破壞.Tryptophanase(色胺酸酵素)基因的 破壞,可使色胺酸累積而不致於分解.其做法是 利用溫度敏感質體pSC103夾帶已破壞之Tna基因, 與體內染色體進行同質重組.利用此法可將Tna 基因有效率且精確的破壞,而不會影響此變異 株的其它特性.最後,本計畫將以半年時間探討 Fed-batch發酵法培養高濃度大腸菌,以達到有效 率且高產量的色胺酸生產.

Project ID:PA8304-1034
External Project ID:NSC83-0418-B182-009-BD