Mutational Studies of SpoIIAA for the Regulation of Sporulation in Bacillus subtilis

σF 是枯草桿菌中第一個表現的前期內孢子形成的特定σ因子，它可以直接或間接的活化所有其後和內孢子形成相關的σ因子。在ATP 存在下，SpoIIAB 可以結合併抑制σF，或是一個可以磷酸化SpoIIAA 的特定蛋白質激.。在內孢子形成過程中，σF 的活化須仰賴一個可以使SpoIIAA 去磷酸化的特定蛋白質磷酸.SpoIIE。SpoIIAA 和SpoIIAB 的交互作用是在前期內孢子中釋出σF 活性的必要步驟。於本人之前實驗室中得到的結果認為，在SpoIIAA 磷酸化的過程中，SpoIIAB 會有構型的改變形成釋放ADP 較慢的構型我們稱為SpoIIAB*。這種改變反映在SpoIIAA被SpoIIAB 磷酸化的二階段酵素動力學反應中，表現出較慢的穩定階段反應速率。我們推測這構型的改變和SpoIIAB 上一個具有彈性的區域」ATP-lid」有關。我們已然探討在SpoIIAB 的ATP-lid 附近對其進行胺基酸的點突變，看是否會對SpoIIAA 及SpoIIAB的交互作用造成影響。我們發現有兩個SpoIIAB 的變異株，E104K 及T49K 對SpoIIAA有較低親和力，使得這兩種變異株不能和SpoIIAA 行完整的交互作用及構型改變，因此帶有這蛋白質突變的細菌顯現出不會產生內孢子的表型。另一方面，利用直接點突變技術所造成的第三種SpoIIAB 變異株SpoIIAB-R105A，有進行構型改變的現象，並且在磷酸化SpoIIAA 後釋放ADP 異常的慢。R105A 和SpoIIAA 較野生株有更強的親和力且含有SpoIIAB-R105A 的細菌會使σF 的活性提早且增強表現。我們因此可以總結SpoIIAA 和SpoIIAB 的高親和力可以誘發SpoIIAB 的構型改變，從SpoIIAB.ATP 變成一個ATP-lid 蓋上的型式(SpoIIABclosed.ATP)，而此種構型的改變有助於σF 從SpoIIAB上釋放。在SpoIIAA 被SpoIIAB 磷酸化後，所產生的SpoIIABclosed.ADP 便如同我們之前所定義的SpoIIAB*.ADP，可以和SpoIIAA 形成一個穩定的複合物，使其不再和σF結合而持續表現σF 的活性。我們接著想要探究，若是對SpoIIAA 進行點突變而改變它和SpoIIAB 的親和力，是否也會有類似以上SpoIIAB 變異株的表型出現呢？我們將要利用分子生物學、生物物理和生物化學的實驗技術，來研究這些SpoIIAA 變異株的表現。根據已發表的SpoIIAA-SpoIIAB 的結晶構造，我們將在SpoIIAA 和SpoIIAB 接觸的地方，進行SpoIIAA 的直接點突變或是隨機點突變，並隨後進行相關的功能分析。

Project ID:PC9508-1858
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