Study on the Molecular Regulation Mechanism of Autokinase/PAK

蛋白質的磷酸化作用 (protein phosphorylation) 目前已知是生物體內一種很重要的訊息傳遞作用機轉, 參與許多細胞內生理功能之運作與調節. 過去, 筆者曾參與一序列研究工作, 試圖從豬腦及豬肝兩種組織中找尋並加以純化鑑定出一種全新的蛋白質絲氨酸/酥氨酸磷酸化酵素 (proteinserine/threonine kinase) 稱之為"自我磷酸化依賴性蛋白質磷酸化酵素" (autophosphorylation-dependent protein kinase, auto-kinase).在試管中其酵素活性受到本身磷酸化程度高低來調控.近幾年陸續的研究發現, autokinase是一個活性強, 多受質的蛋白質磷酸化酵素. 最近, 我們以豬肝中純化之autokinase為材料, 利用數種化學及酵素裂解方法, 配合氨基酸序列分析, 已獲得此一酵素之數段部分氨基酸序列. 經比對資料庫後發現,autokinase與近兩年才被發現的一類p21-G蛋白活化之磷酸化酵素PAK(p21Cdc42/Rac-activated kinase ) 極為雷同. 再經由其他實驗證據, 我們斷定autokinase就是PAK家族的一員. 根據其他研究群之最新實驗證據指出, PAK極可能是一類JNKs/SAPKs(c-Jun N-terminal kinases/stress-activated protein kinases) 的上游調節因子, 可能參與生物體內諸多重要生理功能之調節過程. 目前, 學者們已經在試管中解讀出與PAK活化作用有關的兩個自我磷酸化作用點(autophosphorylation site);然而在生理狀況下 (in vivo) PAK的分子活化調控機制仍然不清楚, 有待進一步澄清.最近, 我們已成功地製備出autokinase/PAK的抗體, 並初步證實多種動物組織及人類細胞株中皆含有autokinase/PAK. 另外, 以RT-PCR方法著手, 我們已由人類肝細胞中獲得autokinase/PAK的cDNA clone. 基於上述既有的研究成果與觀察, 本計畫擬深入探討在生理狀況下autokinase/PAK的分子活化調控機制. 我們計畫構築多種與已知試管中自我磷酸化作用點有關之autokinase/PAK定點突變種cDNA,將其送人細胞中表現, 再以已知的活化因子(如EGF及IL-1) 刺激細胞, 利用抗體免疫沉澱, 酵素活性分析, 及磷酸化作用點比對等分析技術, 深入了解個別磷酸化作用點在auto kinase/PAK的生理分子活化調控機制中所扮演的角色為何. 另外, 我們也將同時檢驗以上述 autokinase/PAK 定點突變種的cDNA送人細胞中表現時, 細胞內JNK/SAPK活性變化的情形, 藉以了解autokinase/PAK與 JNK/SAPK的關係.

Project ID:PB8702-1052
External Project ID:NSC87-2314-B182-078