The Role of mtDNA in the Effect of Mitochondrial Respiration Inhibitors on Levels of Primary Antioxidant Enzymes, Lipid Peroxidation and Ubiquinone

活性氧分子(ROS)和對細胞中大分子之氧化傷害和人體中多種病理過程密切相關,自由基所引發之脂質過氧化可造成膜的功能喪失, 而主要抗氧化酵素(超氧陰離子歧化.[SOD], 觸.,麩胱甘.過氧化.,過氧化物還原.), 特別是粒線體中的MnSOD, 對保護細胞免於氧化壓力非常重要. 粒線體氧化磷酸化作用包含複合體Ⅰ到Ⅳ的電子傳遞鏈(ETC)及合成ATP 的複合體Ⅴ。泛.是由細胞所自行合成, 其為ETC 上必須之移動性的電子傳遞物質,另也是一抗氧化物。複合體Ⅰ.Ⅲ.Ⅳ及Ⅴ上有13 個單元蛋白是由粒線體DNA(mtDNA)所製造的, 而其他蛋白皆由核DNA 所製造。ETC 漏出電子至氧分子形成超氧陰離子在正常生理狀況及可產生, 但在粒線體功能不正常時此作用會更加強。Rotenone 為複合體Ⅰ之特異性抑制劑, 而antimycin A 和myxothiazol 則為複合體Ⅲ之特異性抑制劑, 這三種化合物皆已知可在粒線體中增加ROS 產生。antimycin A 可藉由在內膜的基質面(n 面) 抑制複合體Ⅲ及cytochrome b (mt DNA 所製造) 的電子傳遞,因而造成靠膜間面(P 面) 的半泛.陰離子增加及超氧陰離子的增加。Rotenone 一般認為在基質面產生ROS, 但不確定是因其與ND1 單元蛋白(mtDNA 所製造)或一核DNA 製造之蛋白結合所致。而是否myoxothiazol 是藉由增加Qn.-或Qp.-來增加超氧陰離子之形成則有不同看法。在本計畫中我們將比較143B 及143B-ρ0(已去除mtDNA)細胞在以上三種抑制劑處理後, 細胞毒性, 主要抗氧化酵素的表現, 脂質過氧化和泛.的量, 及氧化還原狀態敏感之轉錄因子的活性是否有不同, 以期瞭解以上分子或基因如何對這些不同抑制劑產生反應及mtDNA 所製造之蛋白的角色為何。我們的假說為以上抑制劑在粒線體產生之ROS 可產生脂質過氧化, 且藉由氧化還原敏感之分子送訊息至核DNA, 而誘發製造保護性蛋白的基因表現, ρ0 細胞因缺乏mtDNA 而可能無以上反應。我們初期結果以看到antimycin A 在143B 細胞可誘發MnSOD 基因, 在143B-ρ0 細胞則否, 這已支持了我們的假說。我們將進行的研究方法首先為評估細胞毒性及分析F2-isoprostanes 以作為一特異之脂質過氧化指標; 其次, 我們將偵測主要抗氧化酵素之RNA, 蛋白及活性表現; 再者, 我們將用Coul Array HPLC 來分析泛.的量及即時反轉錄PCR 來偵測製造泛.所必須之酵素的RNA 表現; 最後, 我們會進行電泳移動性改變分析來評估AP-1 及NF-κB 的DNA 結合活性。此研究的結果可能有助於瞭解對人類在粒線體疾病(可因mtDNA 核DNA 突變)或外來毒物造成之粒線體功能缺陷時所產生之氧化還原反應及其與mtDNA 所製造之蛋白的關係。

Project ID:PC9408-1395
External Project ID:NSC94-2320-B182-033