The Role of Serine Protease in Liver Ischemia---Reperfusion Injury in Mice (I)

背景：肝臟缺血-灌流傷害是外科醫師的一大挑戰. 在缺血-灌流傷害早期kupffer細胞被活化並釋放過氧化物及促發炎細胞素，在缺血-灌流傷害後期，TNFα 調昇沾黏分子及白血球吸引素的表達，募集大量中性白血球，被聚集活化的中性白血球釋放蛋白質酵素及過氧中間產物，惡化肝細胞及內皮細胞的傷害. 若乾絲胺酸蛋白質酵素抑制劑被使用於肝臟缺血-灌流傷害的預防，其原理是藉由抑制中性白血球的蛋白質酵素，減少對肝細胞的破壞.. 然而肝細胞本身含有的絲胺酸蛋白質酵素在肝臟缺血-灌流傷害的角色則未曾被探討.主要目標：1.決定肝細胞絲胺酸蛋白質酵素於肝臟缺血-灌流傷害模型中的角色，是」傷害」或是」保護」？2.決定肝細胞絲胺酸蛋白質酵素在應對肝臟缺血-灌流傷害時的分子機轉.3.利用小鼠去氧核醣核酸晶片(內含超過41,000 個基因)調查絲胺酸蛋白質酵素在肝臟缺血-灌流模型中的訊號傳遞路徑.4.決定目前市面已有的絲胺酸蛋白質酵素抑制劑可否減輕肝臟缺血-灌流傷害.執行方法概要(共分三年)第一年實驗動物第一組：絲胺酸蛋白質酵素剔除鼠控制組：野種C57BL/6 鼠接受肝臟缺血-灌流，並在1,3,6,12,24 及48 小時犧牲動物1.病理檢查切片2.血清肝臟功能測定3.中性白血球特殊染色4.L-selectin 及ICAM-1 免疫組織化學染色5.利用ribonuclease protein assay 分析細胞素及細胞凋亡相關基因群6.利用RT-PCR 分析肝臟缺血灌流傷害後，基絲胺酸蛋白質酵素基因隨時間點變化7.利用TUNEL 決定肝細胞凋亡壞死的情況8.分析NF-κB 活化的情況第二年實驗動物第二組：絲胺酸蛋白質酵素過度表達鼠第三組：C57BL/6 野生鼠給予gabexate mesilate 治療控制組：C57BL/6 野生鼠接受肝臟缺血-灌流，並在1,3,6,12,24 及48 小時犧牲動物1.病理檢查切片2.血清肝臟功能測定3.中性白血球特殊染色4.L-selectin 及ICAM-1 免疫組織化學染色5.利用ribonuclease protein assay 分析細胞素及細胞凋亡相關基因群6.利用RT-PCR 分析肝臟缺血灌流傷害後，基絲胺酸蛋白質酵素基因隨時間點變化7.利用TUNEL 決定肝細胞凋亡壞死的情況8.利用小鼠去氧核醣核酸晶片分析絲胺酸酵素於肝臟缺血-灌流傷害的訊號傳遞第三年實驗動物第四組：野生C57BL/6 鼠給予aprotinin 治療第五組：野生C57BL/6 鼠給予urinary trypsin inhibitor 治療控制組：野生C57BL/6 鼠接受肝臟缺血-灌流，並在1,3,6,12,24 及48 小時犧牲動物1.病理檢查切片2.血清肝臟功能測定3.中性白血球特殊染色4.L-selectin 及ICAM-1 免疫組織化學染色5.利用ribonuclease protein assay 分析細胞素及細胞凋亡相關基因群6.利用RT-PCR 分析肝臟缺血灌流傷害後，基絲胺酸蛋白質酵素基因隨時間點變化7.利用TUNEL 決定肝細胞凋亡壞死的情況8.利用小鼠去氧核醣核酸晶片分析絲胺酸酵素於肝臟缺血-灌流傷害的訊號傳遞9.利用上述晶片所得結果,挑選有意義的基因,以免疫組織化學染色法及RT-PCR 驗證.先期結果絲胺酸蛋白質酵素剔除鼠在接受肝臟缺血-灌流傷害後,其中性白血球的募集顯著比野生鼠微弱 (如下圖). 代表絲胺酸蛋白質酵素基因剔除可提供肝細胞保護的作用.

Project ID:PC9408-0621
External Project ID:NSC94-2314-B182-035