Toll-Like Receptor (TLR) Signaling in Biliary Atresia

膽道閉鎖為原因不明之一種阻塞性膽管炎性疾病。其發生率雖不高，卻佔需換肝兒童病例半數以上。以葛西氏手術矯正膽道閉鎖，雖能延長多數患者的生命，但是不須換肝而能長期存活者仍侷限少數較幸運病患。膽道閉鎖可依據有無合併症，分成胚胎型及後天、周產期型。後者佔了80%以上。目前研究顯示某種不明原因感染，尤其病毒，就算不是直接原因，也是促成膽道閉鎖成因之一。這可從rotavirus 誘發幼小白鼠產生極似兒童膽道閉鎖之病理變化得知。凡外來感染均須經由toll-like receptor (簡稱TLR) 家族成員感知，將相關訊息傳入細胞內，引起一系列的變化。TLR 家族目前已知至少有十一名成員，惟TLR 在膽道閉鎖扮演角色目前完全未知。我們以定量PCR，定量膽道閉鎖患者肝組織中TLR-2, -3, -4, -7, -9 之mRNA，發現TLR7mRNA 之表現，比起對照無肝病兒童高達五倍，比起膽道囊腫也較高，其他TLR之mRNA 則無顯著差異。由於TLR7 為人體細胞上偵測單鏈RNA 之主要受體，其與無肝病兒童之差異，有非常重要的意義，顯示膽道閉鎖或許和單鏈RNA 病毒感染或誘發TLR7 之訊息傳遞鏈相關。我們進行中的計劃，也顯示細菌之內毒素，可能在膽道閉鎖疾病發生或發展有有關。我們打算以兩年時間驗證誘發TLR7 之訊息傳遞鏈和/或細菌內毒素，和膽道閉鎖疾病發生或發展有關的假設。下列為預計完成的目標：第一年(1) 以定量PCR，篩選所有TLR 家族十一名成員mRNA，與正常或膽道囊腫有明顯差別之基因，再以in situ hybridization, immunohistochemistry 染mRNA 及蛋白質在膽道閉鎖的表現及分佈，探討可能病理機轉。(2) 針對TLR 訊息傳遞鏈，尤其TLR7 在膽道閉鎖可能調控之基因或蛋白質如MxA, 干擾素(interferon,簡稱IFN)，以及干擾素管控因子(IFN-regulatory factor,IRF), 以及proinflammatory cytokines 如IL-8 和IL-6 等表現，以定量PCR 及immunohistochemistry，探討相互之間表現的相關性。(3) 應用pyrochrome Limulus amebocyte lysate assay，tissue ELISA, doubleimmunofluorescence 等技術，比對CD14 蛋白質及E.coli 內毒素之量及組織中位置之表現，瞭解兩者之關係。第二年(1) 將適當量之適當量之TLR7/8 激動劑(agonist) R848 和/或細菌內毒素注射到出生12小時內之Blab/c 小白鼠內，期建立類似人之膽道閉鎖之病理變化。病理變化以一般組織學方法判定肝膽發炎及膽道阻塞。(2) 一旦掌握小白鼠肝膽系統之病變，我們可以依時間不同，檢測肝膽組織TLRs 之mRNA 消長，並針對較有意義變化之TLRs，探討其與干擾素(IFN)，以及干擾素管控因子(IRF)消長之相關性。(3) Endotoxin-CD14-TLR4 訊息傳遞鏈在內毒素引起肝膽系統之變化，可以得到佐證。(4) 應用定量PCR 及immunohistochemistry，TLR-IRF-IFN 或Endotoxin-CD14-TLR4 訊息傳遞對proinflammatory cytokines 如IL-8 和IL-6 等表現之相關性，可以釐清。吾人深信完成此兩年期計劃，必然對TLR 訊息傳遞鏈在膽道閉鎖之致病機轉，有更清楚詮釋。對此複雜疾病之預防與治療，應能提供極富學術價值之訊息。

Project ID:PC9708-0347
External Project ID:NSC95-2314-B182-025-MY2