探討金黃葡萄球菌在活體內生物膜生成的機制

金黃葡萄球菌為院內及社區感染重要病原菌，我們先前發現，對於抗萬古黴素金黃葡萄球菌(VRSA)，施以萬古黴素處理，會促使部份細菌經由cidA 活化造成自我裂解，而釋出胞外DNA(eDNA)，使生物膜大量增生。我們近期發現，此一增生在環境葡萄糖濃度越高，如糖尿病環境，會更趨強烈。我們以小鼠背部皮下組織置入導管，於管內感染VRSA 模式，在有無萬古黴素治療下，藉由計數導管內生物膜中菌落數，來評估正常及糖尿病小鼠生物膜產生能力。結果顯示，相較正常小鼠，糖尿病小鼠在無及有萬古黴素治療下，生物膜產量分別增加10 及1000 倍。不同實驗條件下小鼠內的生物膜，在電子顯微鏡下呈現不同的形態，因此我們假設其內的組成成分可能也有所不同。一般我們對生物膜的認知，主要根植於試管實驗(in vitro) 的觀察。對於醫療環境中生物膜形成過程的機制，多架構於試管內模擬的結果。因此我們有興趣探究，在活體內生物膜生合成的分子機制，尤其在糖尿病環境下，感染抗藥菌株後施以所抗藥物治療，對生物膜形成的影響。我們將利用蛋白質體學的分析，比較不同刺激下生物膜內蛋白質組成圖譜。我們以蛋白質一維電泳進行先導實驗，分析受VRSA 感染之健康/糖尿病小鼠，在有無萬古黴素刺激下導管內生物膜蛋白質以及試管內生物膜蛋白質，發現生物膜內蛋白質表現圖譜確有相當不同。以質譜儀(MALDI-TOF) 鑑定活體內生物膜，可發現許多宿主蛋白質，其中每個樣本均有白蛋白存在。試管實驗初步結果顯示，白蛋白可大幅促進生物膜增生，甚至在多醣胞外基質(PIA，由ica 調控) 分泌缺失變異株亦同。由白蛋白構築之生物膜需要eDNA 予以穩定，且白蛋白會抑制PIA 的分泌，顯示宿主因子會改變細菌生物膜相關基因的表現。本計劃將首先探討白蛋白在活體內是否真的參與生物膜合成，我們將利用cidA，ica 及cidA/ica 基因突變株及在試管內不產生生物膜的臨床菌株，檢測它們在活體內生物膜生成能力，並以即時定量PCR (qRT-PCR) 檢測白蛋白對細菌生物膜相關基因的表現。我們將進一步以蛋白質二維電泳及iTRAQ 分析技術，建立不同刺激下生物膜的蛋白質體圖譜，以了解細菌及宿主交互作用下，生物膜生成的機制。對於表現有明顯差異的蛋白質，將後續進行其功能性分析，探討其在活體中對生物膜生成所扮演的角色。細菌相關的蛋白質，將以建立不同基因突變株，而後進行小鼠生物膜生成實驗；小鼠相關蛋白質則藉由注射相關單株抗體或抑制劑至小鼠體內，干擾蛋白質活性後，進行小鼠生物膜生成實驗。我們期待本計劃能使我們更能瞭解活體中生物膜合成的分子機制，且對糖尿病患受細菌感染產生生物膜，能有更多了解，以提供新的治療策略。

系統編號:PC10408-1253
原計畫編號:MOST104-2320-B182-019