探討突變PINK1引起遺傳性帕金森氏的致病機轉

帕金森氏症(Parkinson’s disease)是最常見的神經元病變性運動障礙疾病，最近文獻報告顯示phosphatase and tesin homologue (PTEN)-induced kinase 1 (PINK1)的基因突變引起第六型遺傳型隱性帕金森氏症(PARK6)，並且PINK1的基因突變是導致早發型隱性帕金森氏症的第二常見主因。一般認為PINK1對位於黑質緻密部(substantia nigra pars compacta) 的多巴胺神經元具有保護作用，引起第六型遺傳型帕金森氏症的突變PINK1失去保護黑質多巴胺神經元之生理功能，進而導致黑質多巴胺神經元的病變及帕金森氏症。為了瞭解突變PINK1引起第六型遺傳型帕金森氏症的致病機轉，我們必須探討PINK1保護黑質多巴胺神經元的分子作用機制。最近研究顯示早發型偶發性帕金森氏症(sporadic Parkinson’s disease)的病患也有PINK1的基因突變，此外由於第六型遺傳型隱性帕金森氏症的病患與最常見的偶發型帕金森氏症病患表現類似的臨床特徵，遺傳型與偶發型帕金森氏症的發病很可能源自於相同分子機轉，因此探討第六型遺傳型隱性帕金森氏症的致病機轉也將有助於瞭解最常見的偶發型帕金森氏症之分子病理機轉。為了詳細瞭解PINK1保護黑質多巴胺神經元的分子機制與第六型遺傳型帕金森氏症的致病機轉，我們在本計畫中針對下列主題進行研究: (1)正常PINK1會抑制細胞凋亡(apoptosis)，因此具有保護黑質多巴胺神經元的作用，但引起第六型遺傳型隱性帕金森氏症的突變PINK1不會抑制細胞凋亡並且失去保護神經元之功能。在本計劃中，我們會詳細探討正常PINK1抑制細胞凋亡及突變PINK1失去保護神經元之功能的分子機轉。(2)表現於粒線體的PINK1才具有保護細胞之功能，Ser/Thr protein kinase是PINK1分子中唯一功能部位，因此PINK1是表現於粒線體的Ser/Thr protein kinase，並且可能經由對未知粒線體蛋白質進行磷酸化保護黑質多巴胺神經元。此外導致第六型遺傳型隱性帕金森氏症的PINK1基因突變皆位於Ser/Thr protein kinase部位，因此PINK1基因突變可能引起Ser/Thr protein kinase的功能異常及黑質多巴胺神經元病變。在本計劃中，我們會利用蛋白質體學分析(proteomic analysis)找出被PINK1磷酸化的粒線體蛋白質。(3)雖然離體細胞模式(in vitro cellular model)被廣泛地用於研究腦部疾病之病理機轉，但仍需要進一步以活體動物實驗證實由培養神經元得到的重要發現，此外活體動物模式(in vivo animal model)更被適合用於發展第六型遺傳型隱性帕金森氏症的治療方法，因此我們也會利用PINK1基因剔除鼠探討PINK1在腦部的生理功能與第六型遺傳型隱性帕金森氏症的分子病理機轉。 本計畫第二年執行期限的最重要目的是配養homozygous PINK1基因剔除鼠。老鼠的PINK1基因具有約13kb長度及8個Exons，由於start codon位於第一個Exon，因此我們設計knockout target vector針對第一個Exon進行homologous recombination，在缺少第一個Exon的狀況下，細胞不會表現PINK1 mRNA及PINK1蛋白質。我們將PINK1 knockout target vector送入ES細胞，然後利用Southern blot分析法得到在第一個Exon已產生homologous recombination的ES細胞株，再將ES細胞株注射到blastocysts及配養chimeric老鼠以得到F1 heterozygous PINK1基因剔除鼠，隨後再利用F1 heterozygous PINK1基因剔除鼠的互相交配，我們已成功配養F2 homozygous PINK1基因剔除鼠。Southern blot分析法及PCR genotyping已確認heterozygous PINK1+/-基因剔除鼠或homozygous PINK1-/-基因剔除鼠的PINK1基因第一個Exon之target deletion有 germline transmission，此外Norrthern blot與RT-PCR分析法也顯示PINK1-/-基因剔除鼠的腦部及心臟沒有表現2.3 kb之PINK1 mRNA。一般認為PINK1對位於黑質多巴胺神經元具有保護及抗細胞凋亡作用PINK1的無法表現應該會導致黑質多巴胺神經元病變與後續帕金森氏症，因此我們利用數種動物行為測試方法比較正常老鼠與PINK1-/-基因剔除鼠的運動功能。Rotarod test測試法顯示九個月年紀的PINK1-/-基因剔除鼠之平衡與協調功能沒有異常，與同年齡的正常老鼠比較起來，PINK1-/-基因剔除鼠的自發性活動力及運動功能表現也沒有改變。與正常老鼠比較起來，免疫染色實驗發現九個月年紀的PINK1-/-基因剔除鼠中表現tyrosine hydroxylase之黑質多巴胺神經元的數目及形狀沒有明顯的變化。因此不同於早發型第六型遺傳型隱性帕金森氏症的病患，PINK1-/-基因剔除鼠的黑質多巴胺神經元病變及運動功能異常可能需要更久的時間呈現，因此我們將繼續探討PINK1-/-基因剔除鼠在較大年紀呈現帕金森氏症症狀的可能性。粒線體內Ser/Thr protein kinase的充裕多餘性、缺乏適當環境因子的興奮、PINK1基因剔除引起的補償作用或PINK1在不同動物品種具有不同生理重要性等機轉可以解釋九個月年紀的PINK1-/-基因剔除鼠為何沒有呈現帕金森氏症症狀，進一步詳細探討九個月年紀的PINK1-/-基因剔除鼠無法呈現黑質多巴胺神經元病變及運動功能異常的機轉應該有助於瞭解帕金森氏症的病態生理學。此外PINK1 -/-基因剔除鼠也許不是最理想的第六型遺傳型隱性帕金森氏症之活體動物模式，表現PARK6突變PINK1基因的knockin老鼠可能是更適當之活體動物模式。 最近研究發現Drosophila果蠅的PINK1基因失去功能時，粒線體會有功能與構造的嚴重缺陷。斑馬魚(zebrafish)的PINK1基因表現降低會引起粒線體功能異常及reactive oxygen species (ROS)合成增加，此外我們的研究結果也顯示PINK1阻擋cytochrome-c自粒線體之釋放、caspase-3之活化與細胞凋亡，因此PINK1是調控粒線體功能與細胞凋亡路徑的重要分子之一。我們也可以推測PINK1基因剔除會導致黑質多巴胺神經元的粒線體功能異常，為了證實此假說，我們測定比較正常老鼠或PINK1-/-基因剔除鼠的培養黑質多巴胺神經元之粒線體膜電位 (mitochondrial membrane potential)。我們利用粒線體膜電位螢光染劑TMRM進行細胞影像實驗以觀察正常老鼠或PINK1-/-基因剔除鼠的培養黑質神經元之過極化粒線體膜電位。與正常老鼠比較起來，PINK1-/-基因剔除鼠的黑質多巴胺神經元之TMRM螢光訊號及粒線體膜電位明顯地降低，此外PINK1-/-基因剔除鼠的黑質非多巴胺神經元之粒線體膜電位也有去極化的現象，因此PINK1基因剔除會使培養黑質神經元失去過極化的粒線體膜電位。粒線體是細胞內自由基(free radical)的部位，我們利用ROS (Reactive oxygen species)螢光染劑DCF進行細胞影像實驗以觀察比較正常老鼠或PINK1-/-基因剔除鼠的培養黑質多巴胺神經元內ROS之合成。與正常老鼠的黑質多巴胺神經元比較起來，PINK1-/-基因剔除鼠的多巴胺神經元內ROS合成明顯地增加。此外我們也比較氧化壓力劑H2O2在正常或PINK1基因剔除黑質多巴胺神經元內引發的ROS合成，實驗結果顯示H2O2在PINK1基因剔除黑質多巴胺神經元內引發的ROS合成明顯地增加。 粒線體的oxidative phosphorylation及ion transportation等過程需要有過極化粒線體膜電位，我們的研究發現PINK1的生理功能之一是參與維持粒線體膜電位，因此PINK1基因剔除會使培養黑質神經元失去過極化的粒線體膜電位並且引起粒線體功能缺損，此外平常及H2O2引起的ROS合成在PINK1-/-基因剔除鼠的培養黑質多巴胺神經元內明顯地增加，因此PINK1基因表現降低會在黑質多巴胺神經元造成氧化壓力。本計畫的研究結果首次證明黑質多巴胺神經元缺乏PINK1時會導致粒線體功能缺損及造成氧化壓力，進而可能引起神經元功能異常與神經元死亡。PINK1是表現於粒線體的Ser/Thr protein kinase，因此很可能經由對未知粒線體蛋白質進行磷酸化保護黑質多巴胺神經元。我們已從表現PINK1的細胞之粒線體收集可能被PINK1磷酸化的蛋白質，然後利用二維蛋白質電泳及MALDI-TOF質譜儀分析等蛋白質體學技術辨認被PINK1磷酸化的粒線體蛋白質。我們的實驗結果發現粒線體的ATP synthase之-subunit、heat shock protein 60 (mthsp60)與heat shock protein 70 (mthsp70)很可能是被PINK1磷酸化的下游蛋白質，由於上述蛋白質在粒線體具有重要生理功能，因此PINK1可能經由對ATP synthase之-subunit、mthsp60與mthsp70進行磷酸化進而具有維持粒線體膜電位與抗氧化壓力等保護黑質多巴胺神經元的作用。在本計畫的第三年執行期限中，我們將針對下列主題繼續進行研究: (1) 我們已利用蛋白質體學技術找出粒線體的ATP synthase之-subunit、heat shock protein 60 (mthsp60)與heat shock protein 70 (mthsp70)很可能是被PINK1磷酸化的下游蛋白質，由於上述蛋白質在粒線體的ATP合成與細胞凋亡過程中扮演重要角色，因此我們將探討PINK1經由對ATP synthase之-subunit、mthsp60與mthsp70進行磷酸化進而保護黑質多巴胺神經元的可能性。(2) 本計畫的研究結果發現PINK1功能缺失造成的粒線體功能缺損及氧化壓力增加很可能是第六型遺傳型隱性帕金森氏症的病理機轉之一，因此我們將詳細探討PINK1基因剔除使黑質多巴胺神經元失去過極化粒線體膜電位與ROS合成增加的分子機轉。(3) 除了PINK1 -/-基因剔除鼠外，我們也會培養表現PARK6突變(G309D)或 (L347P) PINK1基因的knockin老鼠作為PARK6之活體動物模式，進而研究PINK1在黑質多巴胺神經元的生理功能與第六型遺傳型隱性帕金森氏症的分子病理機轉。

系統編號:PG9804-0589
原計畫編號:NHRI-EX98-9619NI