以冷凍電子顯微鏡為基礎之超巨分子分析技術探討病毒體與宿主細胞互動之機制：B型及D型肝炎之研究模式(II)

二千零二年諾貝爾化學獎頒贈給以核磁共振技術解開蛋白質結構的科學家，顯示結構生物學之重要，維持生物體正常運作需要靠各種不同蛋白質交互作用，疾病亦可由於蛋白質之結構異常而衍生；是以疾病之預防，或可透過改變特定蛋白分子之功能或防止某些蛋白之結構變異而達成，更加說明研究分子結構之結構生物學乃有其生物醫學上之重要性。過去研究生物分子結構以X-光結晶繞射與核磁共振法為主，「冷凍電子顯微鏡(冷凍電鏡)」技術為基礎之分子結構研究近年來大幅進步，已成功解析許多病毒顆粒及蛋白質巨分子複體之近原子解析度結構。此技術利用液氮超低溫急凍方法，將在溶液中接近生理/病理狀態之巨分子複體，以超薄液膜(~1000 nm)凍結於電鏡標本銅座之微方格內，在完全不染色條件下，使用電鏡欠焦(defocusing)方式取得巨分子複體各種角度之影像，再將此影像數位化後，以傅力葉轉換(Fourier transform)於頻度空間中運算、分析、平均、去雜訊，再返轉換成真實空間之三維結構顯示。此種結構解析模式在過去數年由於電腦運算能力的大幅增加，以及場發射冷凍電鏡之製造漸臻成熟使影像更清晰，而有長足進步。理論上，冷凍電鏡之解析度可達原子層級，因此是X-光結晶繞射與核磁共振法外，另一解讀巨分子結構之利器，更有下列數項特點為結晶繞射/核磁共振所難能：(1)不需蛋白質結晶；(2)可以解析蛋白質之「自然」或「動作」狀態(僅需在連續動作中凝凍該蛋白)；(3)無大小限制(核磁共振限於以100 kD 下之蛋白)；(4)可以解析膜蛋白(如離子通道)及超巨分子複體(如核醣體及病毒)；(5)自動化程序完成後可高速解析大量蛋白。在後基因體時代，蛋白結構分析毋寧為最重要課題之一，有鑑於生理/病理狀態下之蛋白質多以超巨複體存在以及甚多細胞之生理/病理功能係利用膜蛋白達成，冷凍電鏡勢必成為基因體醫學研究之重要領域。本計畫擬以 B 型肝炎病毒核心顆粒結構分析為素材，建立冷凍電鏡的研究模式，藉由了解病毒顆粒表面原子結構得以在結構生物學上進一步瞭解此一重要疾病原的感染機制。我們已完成三種變異型核心顆粒之表達，有數據顯示其顆粒行成，可即進行結構分析。我們亦擬建立B 型肝炎病毒核心顆粒基因之轉殖小鼠，以進一步瞭解病毒體在肝細胞之出芽機制。未來的研究將以單顆粒結構分析(single particle analysis)為主，以便解析細胞內諸多非對稱性巨分子複體。由於冷凍電鏡研究在國際上亦屬人才奇缺之新興領域，本計畫亦擬以國際交流方式，透過聘任國際知名學者及研究人員送訓，在國內建立此一技術服務中心並致力培養人才。本校具有優良之電鏡研究傳統，且有堅強之蛋白質、病毒以及結構生物學程、生物資訊學程等群研究，更有專職之電鏡技術人員，因此在發展冷凍電鏡研究之基本條件方面已具備必要質量。相信本計畫之執行將可迅速建立冷凍電鏡的研究模式，倘能配合冷凍電鏡核心服務實驗室之設立，必能迅速推展我國冷凍電鏡結構生物學之研究，當有助於基因體醫學整體之發展。

系統編號:PA9308-2266
原計畫編號:NSC93-3112-B182-003