以金奈米粒子試紙呈色發展結核菌Rv3807c/Rv3887c 表面抗原偵測工具

背景 2011 年全世界約 870 萬人罹患結核病，其中 140 萬人死亡。在台灣，以 2007 年為例，結核病全國新案人數為 14,480 人，全國新案每十萬人口發生率為 63.2 人，骨關節結核病則佔肺外結核病的35%，其中又以脊椎結核病最為常見。脊椎結核之為害，更甚於其他部位，因脊椎被破壞，可能引致脊柱畸形，甚至下半身癱瘓、肺功能不全。正確診斷與結核菌藥物使用為治療重點。診斷上 X 光檢查，CT 與 MRI 常無法正確分辨結核菌，細菌感染，甚至脊椎腫瘤。臨床上常需要手術矯正，清創，同時取得標本做 RT-PCR，細菌塗片檢查(TB smear)、細菌培養檢查(TB culture)及病理學(pathology)等診斷。但上述方法檢驗時間長，診斷正確率不一致，常導致延誤結核菌藥物使用時機，與影響手術方法之決定。金奈米粒子(gold nanoparticles, AuNPs)因其具備生物相容性、高穩定性、高表面電漿子共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)吸收係數、化學反應消光(quenching)特性及表面易與硫醇分子有較強 Au-S 作用力等優勢，所以廣泛利用於奈米生醫感測領域。發展以金奈米粒子快速診斷工具，我們的策略為直接診斷 TB 表面抗原，而不偵測 TB DNA。因此本計畫為發展 Rv3807c, Rv3887c transmembrane proteins 表面抗原之抗體，進一步研究以金奈米粒子濾紙呈色發展結核菌表面抗原偵測工具，利用其結合結核菌表面抗原改變顏色的特性，發展不需要高端檢測設備以及冗長醫檢流程，便可以在臨床開刀過程中以最短時間與最少設備立即判斷病人是否具有脊椎結核組織之快速與精確診斷方法。 材料與方法 脊椎結核菌感染(Spinal tuberculosis)患者，常須接受清創矯正手術。手術後原將廢棄的清創組織檢體用於診斷及治療必要的例行性檢驗。本實驗將蒐集病理檢驗完畢後，福馬林處理過無感染疑慮之剩餘檢體，蛋白質冷凍保存於林口長庚紀念兒童醫院 J 棟 7 樓檢驗醫學科分生實驗室，以及林口長庚醫院病理組織銀行之臘塊切片，留待進行抗體驗證與金奈米粒子的聚集免疫檢測。其檢測結果將與其他檢驗方式進行比較。完全不影響患者原有治療，也不牽涉任何活菌培養。並希望發展出可以在開刀房就可以立刻檢驗病患是否有結核菌感染，以達到在臨床上可迅速正確的手術方式決定與快速正確的藥物治療。 第一年研究: 發展並驗證 Rv3807c, Rv3887c transmembrane proteins 表面抗原之抗體由已知蛋白序列 Rv3807c, Rv3887c 之結核菌表面抗原製作抗體，以病理組織銀行之臘塊切片免疫螢光染色，確認 Rv3807c, Rv3887c 結核菌表面抗原抗體之專一性並以共軛焦顯微鏡觀察切片染色、型態。另外以 Western Blot 及 ELISA 確認 Rv3807c, Rv3887c 結核菌表面抗原抗體之專一性。同時，收集脊椎結核菌感染患者之剩餘醫用檢體，經處理後冷凍保存，留待後續實驗用。第二年研究: 以金奈米粒子試紙呈色發展 Rv3807c, Rv3887c 結核菌表面抗原偵測工具製作金奈米粒子，以 Rv3807c, Rv3887c 結核菌表面抗原測試金奈米粒子試紙呈色，進行聚集免疫檢測來測試金奈米粒子的最佳條件。再以臨床檢體測試，並與臨床例行性檢驗的結果比較與分析出不同檢驗方法對正確診斷的敏感度(sensitivity)與特異性(specificity)。 目的 本實驗的目的是使用金奈米粒子進行聚集免疫檢測(aggregation-based immunoassay)，利用其連接結核菌表面抗原後，改變顏色的特性，發展出不需要高端檢測設備以及冗長醫檢流程，便可以在臨床開刀過程中以最短時間與最少設備立即判斷病人是否具有脊椎結核組織之快速與精確診斷方法。以達到臨床上正確的手術方式決定與快速正確的藥物治療。

系統編號:PC10308-1714
原計畫編號:MOST103-2314-B182-034