負壓對角化細胞在高糖環境下移行能力之影響

糖尿病足潰瘍導致截肢的機會是一般群眾足部潰瘍導致截肢機會的10到30倍。這群病患在截肢以後第5年的死亡率為16-80%。雖然很多關於負壓傷口治療促進傷口癒合速率的報告令人鼓舞，然而確切的機制仍未充分瞭解。細胞基體阻抗感覺，是一項監測細胞在電極上移行時引發阻抗變化的技術。本篇研究的目的為運用electric cell-substrateimpedance sensing (ECIS)技術連續地監測糖化角化細胞傷口在負壓環境下癒合的情況。第一年：由於氧氣及水份在自製的負壓環境時會被移除，為使得細胞生長條件控制更精確，在現行負壓培養系統中除了二氧化碳氣瓶外，尚需加入氧氣瓶及解決管路積水的問題，以維持在不同負壓下，密閉氣室內的氧氣分壓為常壓下的159 mmHg。在改造硬體設備後，整合現行監測細胞阻抗變化的技術，發展負壓影響受傷角化細胞癒合的細胞模型。將human keratinocyte cell line (HaCaT cell line)接種在ECIS的electrodearray上測量細胞移行速度，與chambered coverglass的well中，製作traditionalwound-healing assay (TWHA)，分別置於常壓、-75 mmHg、-125 mmHg、-175 mmHg，等四種不同情況，並將CO2及O2分壓都維持在38 mmHg與159 mmHg。TWHA在不同壓力下6小時後進行螢光染色，以flow cytometer分析負壓對細胞活力，探討負壓對細胞連結蛋白、肌動蛋白與TRPC1的表現。第二年：在培養液加入45%的葡萄糖，使得正常控制組培養液內之葡萄糖濃度為5mM (≈90 mg/dL)，另一實驗組為25 mM (≈450 mg/dL)的葡萄糖以糖化角化細胞，細胞在正常及高糖環境下培養7天後，用trypsin將細胞解離下來，一部份以flow cytometer分析細胞活力與細胞內mitochondria的活性，一部份以ELISA方式分析advanced glycationend products (AGE)，以量化細胞被糖化的程度。一部份遵照第一年發展的技術將細胞置於ECIS測量細胞移行速度，另一部份製造TWHA後再進行細胞連結蛋白與肌動蛋白的螢光細胞染色。透過模擬糖尿病傷口癒合模型的建立，分析高糖對傷口癒合的影響。第三年：同第二年的實驗步驟，先培養出正常與高糖化的角化細胞，再遵循第一年的步驟，分別將培養的細胞接種到ECIS的量測電極與自製的TWHA，之後以常壓、-75mmHg、-125 mmHg、-175 mmHg等四種不同壓力，與固定CO2及O2分壓處理細胞。利用ECIS量化高糖細胞在不同負壓下的移行速度。將TWHA置於上述不同壓力環境下6小時後，依照第二年的步驟，測量不同負壓對細胞活力、mitochondria與AGE的影響。依照第一年發展之方法對不同負壓下的TWHA進行連結蛋白與肌動蛋白的螢光細胞染色。同時對Cdc42、N-WASp、Arp 2、E-cadherin及Actin等細胞移行相關蛋白進行Western blot分析，以瞭解高糖與負壓對肌動蛋白聚合的影響。

系統編號:PC10008-0742
原計畫編號:NSC100-2314-B182-053-MY3