促進IRES轉譯作用以提升小RNA病毒產量( I )

當宿主細胞 cap-dependent 轉譯機制被病毒破壞的時候，許多病毒會利用內部核醣體進入位點 (IRES)的轉譯機制來合成病毒蛋白質，特別是基因組成上較為精益的RNA 病毒。在過去幾年間，我們已經鑑定出數個IRES 作用因子 (ITAFs)會正向或負向調控病毒IRES 活性。在目前的計畫中，我們的想法是在已經得到小兒麻痺病毒與腸病毒71 型疫苗製造核准的Vero 細胞株(非洲綠猴腎細胞)中，調控細胞中ITAFs 的表現量以達到增加病毒產量，進而成為幫助疫苗製造的細胞株。我們將遞送正向調控病毒轉譯的ITAFs 至細胞中，同時讓細胞中會負向調控病毒轉譯的ITAF 失去負向調控功能，來達到我們設計此疫苗細胞株的目的。這個提案包括了三個具體目標：(1)透過大量表現細胞蛋白質FBP1 與FBP11-371 以達到設計增加疫苗產量的細胞株。我們已經鑑定細胞蛋白質 far upstream element binding protein 1 (FUBP1; 又稱為FBP1)是藉由與腸病毒71 型IRES 中的linker region 結合來正向調控病毒轉譯機制。我們進一步發現當腸病毒71 型感染細胞時，FBP1 會在甘胺酸-371 (Gly-371)的位點受到切割，形成有功能性的產物，稱為FBP11-371。此外，我們也發現FBP1 及FBP11-371 會共同促進病毒轉譯及增加病毒產量，達到加成效果。因此，我們計畫在Vero 細胞中大量表現FBP1 及FBP11-371 以促進病毒產量增加。為了達到這個目的，我們將利用CRISPR/Cas9 系統，以確保可以準確地及持續性表達FBP1 和其切割產物FBP11-371 在Vero 細胞中。(2)藉由將細胞中的FBP2 取代成不會被泛素化的突變FBP2 以達到設計增加疫苗產量的細胞株。我們已經在先前研究發現 KH-type splicing regulatory protein (KHSRP; 又稱為FBP2) 是一個新穎的調控因子會負向調控腸病毒71 型的轉譯機制。最近我們更發現FBP2 需要經過泛素化修飾才會成為腸病毒71 型轉譯的負向調控者。當我們突變FBP2 中的泛素化位點，FBP2 就會失去負向調控腸病毒71 型轉譯機制的能力。為了要讓我們設計的疫苗細胞株可以製造更多病毒，我們計畫在Vero 細胞中突變FBP2 的泛素化位點。藉由消除FBP2 負向調控的能力，我們期望設計的疫苗細胞株將製造更多的病毒。CRISPR/Cas 9 系統的技術也將再次利用在突變Vero 細胞中的FBP2。(3)評估不同的小RNA 病毒(picornaviruses)在設計過的疫苗細胞中病毒產量之情形。當 FBP1+/FBP2-細胞株(此細胞株大量表現FBP1 及FBP11-371，同時突變FBP2 中的泛素化位點)成功建立之後，我們將評估腸病毒71 型(EVA-71), 克沙奇病毒B3 型(CV-B3), 腸病毒68型(EVD-68) 以及鼻病毒C 型( HRV-C)在FBP1+/FBP2-細胞株中病毒產量之情形。這些小RNA病毒都是可以在人類中引起嚴重併發症，甚至死亡的重要病原體。

系統編號:PC10603-0003
原計畫編號:MOST106-2321-B182-001