探討蘭嶼花椒於人類嗜中性白血球藉由活化Protein Phosphatase 2A (PP2A) 調控 cAMP含量之機轉研究，並且保護肝臟免於缺血性再灌流之損傷

在此計劃的研究中，我們針對蘭嶼花椒（Zanthoxylum integrifoliolum）的萃取物N-methylflindersine （ZIL-25）對於調控人類嗜中性白血球自由基釋放以及水解酶釋放的機轉進行探討，由於 ZIL-25 調控自由基的機轉非常特殊，因此除了對此天然物的機轉研究外，我們也將針對人類嗜中性白血球本身調控自由基的機轉更深入的研究。在以 fMLP刺激白血球釋放自由基與水解酵素的實驗中我們發現 ZIL-25 隨著濃度的變化抑制 fMLP所引起的自由基跟水解酶釋放，ZIL-25 抑制兩者的 IC50 分別為 5.0±0.5 and 8.7±0.8μM。但再進一步的研究顯示，ZIL-25 對活化 PKC 途徑的刺激劑 PMA 所引起的自由基跟水解酶的釋放並沒有影響。在接下來的研究中，我們發現 ZIL-25 對 fMLP 所引起細胞內蛋白質的磷酸化（活化）都有明顯的抑制，相同的，對 PMA 也都是沒有反應，這些蛋白質包括了 ERK, Akt 以及 p38。在研究 fMLP 引起自由基釋放的過程中，細胞內鈣離子的改變是 fMLP 引起活化很重要的過程，我們的實驗也顯示 ZIL-25 對 fMLP 所引起的鈣離子也很明顯的抑制，但對 LTB4 所引起的鈣離子卻影響不大。在使用一個抑制Protein kinase A (PKA) 的藥物-H-89 對於 ZIL-25 所引起這一連串抑制的作用皆有回復的效果，顯示 ZIL-25 能透過活化 PKA 的效果進而抑制 fMLP 引起的細胞內二級訊息傳遞的活化，所以我們接下來的測量顯示 ZIL-25 的確增加 cAMP 的含量。在我們的實驗中顯示 ZIL-25 增加 cAMP 的含量可能不是促進 adenylate cyclase 的活性，而是抑制分解cAMP 的酵素 phosphodiesterase 4 (PDE4)，但在分析藥物對 PDE4 的活性時卻發現藥物並不會直接抑制 PDE4 的活性，這個現象提供了一個有趣的發現- PDE4 其實還受到其他因素調控，而 ZIL-25 極有可能透過這個機轉在控制 PDE4 的活性，在文獻中發現了幾種控制 PDE 的方式，其中之一為 protein phosphoatase 2A (PP2A) ，在初步的研究中，我們使用 PP2A 的抑制劑 okadaic acid (OA) 跟 calyaulin A (CA; data not shown) 能抑制ZIL-25 引起的 cAMP，證明 ZIL-25 可能透過 PP2A 在控制 PDE4 然後間接影響細胞內的 cAMP 含量。在其他細胞中也曾有報導借由此方式調控 cAMP 的含量，包括了子宮。初步的數據也顯示， ZIL-25 增加 PP2A 的活性。因此接下來，我們會利用免疫沈澱法來確定藥物是否會讓 PP2A 和 PDE4 結合，這有助於幫我們釐清藉由 PP2A 間接影響cAMP 的機轉，也有助於了解嗜中性白血球調控 cAMP 的另一種機制，這將會是一個重大發現。由於嗜中性白血球和血小板之間的交互作用對於血栓和發炎的過程有密切的關連，我們開發的實驗模式，可同時分析白血球和血小板在混合時的交互作用，接著我們測試 ZIL-25 在此體外系統（全血）中的作用，結果顯示 ZIL-25 隨著濃度的關係抑制白血球和血小板交互作用的效果，顯示 ZIL-25 可能克服血液蛋白鍵結的問題，由於白血球和血小板之間的交互作用，需要吸附分子的參與，因此我們會進一步探討 ZIL-25 對血小板以及白血球兩者的作用，包括血小板表現的 P-selectin 以及釋放的 ADP；而白血球也會釋放活化血小板的 cathepsin G 等等。因為全血的系統中，藥物極有可能同時對兩種細胞都有抑制的效果。未來的研究中，我們將進一步探討 ZIL-25 如何調控其他訊息傳遞因子，因此我們將會探討 ZIL-25 對 fMLP 所引起的 cdc42 的改變是否有影響，而這個影響是否和 ZIL-25 影響 MAC-1 或細胞骨架 (cytoskeleton; F-actin) 的改變有關。白血球除了發炎，還參與許多病理狀態，其中迫切要解決的問題之一就是缺血後再灌流；血液再灌流往往對組織有明顯的傷害，而這些傷害已經被證實和嗜中性白血球有密切的關連，因此我們利用將小鼠肝門靜脈以手術夾造成缺血，接著讓血液再流通造成再灌流的肝臟細胞損傷，我們已經成功的完成動物模式的建立與評估，初步結果顯示於再灌流前投與 ZIL-25（1 μg/kg）也有減少肝臟損傷的區域的情形，分析血液中 alanine transaminase （ALT）也顯示有改善肝臟功能，因此接下來的研究重點，將評估蘭嶼花椒成份對於再灌流所造成的肝損傷的治療程度，並且分析蘭嶼花椒成份在這個模式中的作用模式與機轉，對於將來蘭嶼花椒成份的開發將有明顯的助益

系統編號:PC9807-0301
原計畫編號:NSC98-2320-B182-018-MY3