子宮頸皮內贅瘤及子宮頸癌細胞的HPV E7蛋白表現及其與腫瘤其他因子的相關─藉由檢測子宮頸表皮細胞的HPV E7蛋白以提高中度及重度子宮頸癌病變篩檢的準確性

抹片檢測呈ASCUS 或以上變化者，只有約十分之一為組織病理CIN 2 或以上病變，其餘部分的組織診斷為CIN 1；大多數細胞呈輕度異常者其組織病理並無明顯變化，其中部分可能與HPV 的感染有關，但是目前沒有工具可以直接顯示組織或細胞的HPV 感染以及感染後是否已有transformation。臨床上僅能以推測為病毒感染或荷爾蒙不足等解釋。持續性的高風險型人類乳突病毒(high-risk humanpapillomavirus, hrHPV)的感染是子宮頸癌前病變及子宮頸癌發生的必要條件。hrHPV DNA 檢測連帶的產生DNA 陽性但抹片陰性的檢查結果，對受檢者造成困擾，醫師也僅能向受檢者解釋：大多數的HPV 感染可以於8-14 個月內，藉由宿主免疫機轉，自行消失。檢測出高風險HPV DNA 陽性的婦女中，只有其中的10%或更低的婦女，有中度子宮頸上皮內贅瘤或以上病變的存在。對於高風險HPV DNA 陽性但是抹片檢查正常者，目前也沒有工具可以直接顯示細胞的HPV 感染。對這些個案，如果未來能夠提供細胞僅有病毒感染但並無病變的直接證據，有助於準確診斷與充分的解釋。p16INK4a是HPV感染的間接指標，發生於E7蛋白與Rb蛋白結合後，Rb正常功能的瓦解後引起的後續變化有關，經常於子宮頸癌前病變（CIN2, 86%呈陽性; CIN3, 96%; invasive cancer,96%）及子宮頸癌的細胞呈現，但是部分CIN1（54%陽性）及Nondysplastic （7%陽性）亦呈現陽性。p16INK4a顯示hrHPV感染的敏感度較hrHPV的in situ hybridization (ISH)為高。但是其於腺細胞表皮贅瘤及腺癌的表現則不如於扁平細胞者。反之，部分子宮內膜癌及卵巢癌亦呈現p16INK4a廣泛(diffuse)陽性的表現。然而，追根究底，人類乳突病毒病毒蛋白中的HPV E6 及E7 蛋白，才是HPV 病毒感染及引起後續子宮頸細胞病變最直接的分子。如果可以藉由敏感的HPV E6/E7 蛋白抗體，檢測子宮頸表皮細胞是否有E6/E7 蛋白的存在，或許可以有如同以檢測hrHPV DNA 篩檢CIN 2+ 的敏感度，而大幅降低其偽陽性。我們發展出可以準確顯示人類乳突病毒之E7 蛋白的單株抗體，使用重組的HPV16 E7 蛋白，於小鼠分別產出其相對的抗體，經由多重篩選並試用於臨床的檢體，發現代表性的單株抗體，可以清晰的染出子宮頸癌及癌前病變細胞內的E7 蛋白。經過了一年於子宮頸癌及癌前病變組織標本以及子宮頸細胞的初步研究亦發現，此等腫瘤蛋白的分佈，在免疫組織染色(immunohistochemistry)及免疫細胞染色(immunocytochemistry)的顯示，於僅有HPV 感染但尚未惡性轉變的組織，及子宮頸侵襲癌組織，有不同的呈現：前者如CIN 1，僅於部分細胞呈現核染色，後者則於細胞核及細胞質呈現濃染。其中扁平細胞癌呈100%細胞質染色，腺細胞癌則呈97%細胞質染色；於CIN 2 及CIN 3 的細胞質，分別有38%及52% 呈現染色。再者，雖然此代表性的單株抗體是小鼠接種HPV16 的E7 腫瘤蛋白後產生的，但是對他型hrHPV 的蛋白，有相似的親和力，我們推測此現象是由於各型HPV 腫瘤蛋白的epitope 類似，因此呈現cross reaction。這些初步的發現，令我們思考HPV 腫瘤蛋白在不同程度的癌前病變及侵襲性癌細胞質呈現的差異，原因何在。我們希望嘗試以臨床的標本，與文獻中基礎研究的發現，相互印證：（1）不同型別HPV 的感染，以及同一型別但是不同病變程度的細胞，其E7 蛋白的表現位置，有否差異。（2）HPV integration 與HPV 腫瘤蛋白於細胞質與細胞核間shuttle 的可能相關5，亦值得探討。就臨床的方向思考，我們基於初步的研究發現，也慎重的思考藉由免疫染色呈現組織或細胞中hrHPV 腫瘤蛋白，是否可以發展成為臨床上有用的工具？其與p16INK4a 的異同如何？ 因此，希望能（3）就800 例子宮頸抹片為ASCUS 或以上異常的病例，於進行陰道鏡檢查前，收集其液相細胞檢體，進行病毒分型，並以液相法製作薄層抹片，用以比較E7 腫瘤蛋白與p16INK4a表達的異同。如果該病例亦有組織檢體，亦就組織檢體之E7 腫瘤蛋白與p16INK4a 的表達，加以比較。並以200 例僅hrHPV 陽性而抹片正常者及200 例hrHPV 陰性者的液相細胞檢體，為其對照，以探索新的子宮頸篩檢方法的可行性。另外，我們不知道這localization 的差異是否還有其他蛋白參與，因此我們想（4）藉由Quantum Dot (www.invitrogen.com)的nanocrystal 螢光標記技術，了解E7 的相關蛋白於不同程度的子宮頸癌前病變及侵襲性癌細胞的表現。

系統編號:PC10001-0109
原計畫編號:NSC98-2314-B182-047-MY3