癌症抗藥基因的功能探討：延續順鉑抗藥基因體研究

化療抗性在癌症的化學治療上造成了很大的阻礙，癌細胞針對以順鉑cisplatin 為主的化療所產生的抗藥機制是由許多因子所造成的，細胞對抗腫瘤藥物的反應情況則決定於細胞本身的基因體、藥物的濃度以及藥物使用的頻繁度。目前Genome-wide analysis 已是被應用於探討抗藥性癌細胞中其異常調節基因的一種分析方法，不管是應用在腫瘤細胞株或是臨床腫瘤檢體皆有不錯的研究成果。根據這種分析方法，我們利用cDNA microarray鑑定出了一組順鉑抗藥基因(cisplatin resistance ge nes, CPR genes)，在細胞對藥物敏感性的實驗中，此類順鉑抗藥基因與DNA damage 和順鉑引起的初始壓力(primary stress)所造成的細胞凋亡有關，而與mitotic damage 所引起的細胞死亡較無關聯性。為了釐清順鉑抗藥性(之後我們稱順鉑抗藥性為化療抗性)的分子機轉，針對此類抗藥性基因在藥物反應方面的影響，我們將會利用細胞模式以及動物實驗來進行一些功能性分析；在細胞中將這些基因過度表現(功能獲得)或者是利用RNAi技術將這些基因的表現抑制(功能喪失)，之後利用MTT assay 以及apoptosis assay(例如caspase 活化的蛋白指標以及subG1 分析)等方法偵測細胞對藥物的敏感性。此外，我們亦利用細胞模式的實驗來探討並釐清這些抗藥性基因的上游訊號以及下游蛋白產物的調控機轉。重要的是，我們將利用免疫缺陷的裸鼠或SCID 老鼠以及immune-competent 的 BALB/c 老鼠來探討這些抗藥性基因在腫瘤細胞中的調節對藥物敏感性的影響為何，甚至，我們將更進一步地利用一些臨床檢體來驗證我們得到的這些實驗數據(此實驗取決於是否能從長庚紀念醫院取得臨床檢體)。我們在此次的研究中主要以CITED2、NAPA 和PTPN21 為重點探討，但並不侷限於此三個基因；由初步結果得知，這些基因對藥物反應皆具有修飾的效果，這項訊息是非常有價值的。CITED2 已知是做為轉錄過程中的轉錄調控因子。NAPA一開始是被定義為蛋白傳輸上的必需蛋白因子，然而對於抗腫瘤藥物的細胞反應則是還未曾被報導過的，另外PTPN21 則是屬於一種會將tyrosine 磷酸化後的磷酸根去除的磷酸? ；然而，無論是哪一個基因均未被報導過與藥物反應有關。基於這些原因，我們開始探討這些基因與細胞對化療藥物敏感性之間的關係，並且我們也發現了CITED2 與NAPA具有能夠調控p53 的能力(見於之前的結果)。此研究最主要的目標是探討這些順鉑抗藥基因(CPR genes)所導致的抗藥機制以及如何去克服化療抗藥性。第一，我們將研究CITED2 在順鉑抗藥機制中所扮演的角色，其中包含以shRNA 抑制CITED2 表現後，會促使p53 的累積以及p21 的減少。第二，我們將探討NAPA 在順鉑抗藥機制中所扮演的角色，其中包含了我們利用shRNA 抑制NAPA 表現後發現會導致細胞內p53 的累積，這是透過影響內質網關聯降解因子組成的複合體(ERAD)調節p53 降解機制所導致的，另外我們也將研究由於NAPA的位移而導致凋亡因子BNIP-1 會於粒線體途徑中促進caspase-9 的活化進而促使細胞凋亡。為了想得知NAPA 和CITED2 在化療反應中的細胞功能，我們同時地壓制單一或結合的CPR 基因隨後處理順鉑，進一步探討p53 的轉譯後修飾(包含磷酸化，乙醯化和泛素化)和其下游蛋白會有何變化。第三但並不是最後，我們亦將研究PTPN21 於順鉑抗藥機制中扮演的角色。更重要地，我們將會使用結合多個以上的CPR 基因shRNA 並處理順鉑後，去探討是否在裸鼠中能更具有抑制腫瘤的生長。最終的目標是去組織一個網路，一個能涵蓋所有的順鉑抗藥基因與蛋白傳遞訊息途徑的網路。希冀在本研究中對於提高癌細胞化療敏感性的一些相關數據，能夠更好地理解化療抗藥性以及提供一個較為合理的方向去發展出適當的新型化療方法。

系統編號:PC10101-1999
原計畫編號:NSC100-2320-B182-026-MY3