急性骨髓性白血病具MLL基因重組者之基因表現和全基因體異常暨協同突變之致白血病機轉

背景：近來我們已就一大群體的原發性急性骨髓性白血病(AML)病人，釐定其MLL 基因重組(MLL-R)的融合基因。對AML 發病機轉須有class I 和class II 兩類基因協同突變才會發生AML 之「兩擊式」模式被提出。MLL-R 屬於class II 的基因突變。在我們正進行的MLL-R 協同基因突變研究，我們發現class I 基因突變發生在65%的AML 而有MLL-PTD 者及58%的AML 而有MLL/t11q23 者。必須對其餘35-40% MLL-R AML 病人搜尋其他的基因變異。我們也發現25%的MLL-AF10 有K-RAS 基因突變。我們在一位MLL-AF10 病人鑑出有PTPN11 基因突變，另一MLL-AF10 病人發現有新的c-FMS 基因突變。我們將進一步研究MLL-AF10 協同基因突變的致白血病能力。最近發現在染色體正常的AML 成年病人中，EVI1、BAALC 和ERG 基因的過度表現，預後差。其他研究者在14 位有MLL/t11q23 的病人中，發現8 位有EVI1 過度表現。不過迄無有關MLL-PTD 的EVI1 表現的報告。BAALC 和ERG 表現對MLL-R 的影響，有待釐清。最近在成年人AML 發現有FHIT 基因(被認為是抑制腫瘤的基因)的過度甲基化。不過，有關在成年AML 有MLL-R 者，其FHIT 的甲基化狀態和表現，則未知。以上這些促使我們作此研究，來比較MLL-PTD 和MLL/t11q23 病人之間的EVI1、BAALC、ERG 和FHIT 基因表現，以及這兩群病人的FHIT 基因甲基化狀況。其次，很多AML 病人的基因異常，是無法由染色體檢查或FISH 偵測出來，而只能以分子基因技術偵測。最近，一種超強有力的方法：以single nucleotide polymorphism(SNP) chip 作全基因體分析，以高解析度陣列(array)為平台的技術，輔以生物資訊，可鑑認以別種技術發現不了的染色體物質損失或複製，失去heterozygosity、uniparentaldisomy (UPD)等。目的：此研究的特定目標是(1)定量有MLL-R 的AML 病人，其EVI1、BAALC、FHIT 和ERG 基因表現，並比較MLL-PTD 及MLL/t11q23 之兩亞群；(2)發掘原發性AML 病人有MLL-PTD 者的其他基因體異常；(3)探究MLL-AF10 協同基因突變的致白血病機轉。材料和方法：由MLL-R 的AML 病人(140 位)的骨髓檢體分離出單核細胞，保存在-70ºC 或液態氮。對第一個目標：抽出RNAs，反轉錄為cDNA。將以及時定量RT-PCR (RQ-PCR)和以TaqMan 探針來測定EVI1、BAALC、FHIT 和ERG 的表現程度。經Bisulfite 處理的DNA 以甲基化特定的PCR 來測定FHIT 甲基化的狀況，並和FHIT 之表現量作關聯性分析。針對第二個目標：MLL-PTD 的白血病細胞以Affymetrix Genome-wide Human SNPNSp/StyAssay Kit 5.0 在SNP-chip 平台上，進行分子對偶基因核型分析(allelokaryotyping)。將以CNAG 和AsCNAR programs 來完成copy 數目分析，以鑑別缺損、複製和UPD。以UCSC Browser (http://genome.ucsc.edu/)來鑑認基因的大小、位置和地段。對於第三目標：MLL-AF10 和class I 基因突變的協同導致白血病，將以反轉錄病毒選殖/移植系統來研究。K-Ras (Gly13His)、c-FMS (Asn572Thr)和PTPN11 (Gly503Ala)2的原型(wild-type)和突變型，將選殖至具抗生素抗藥性的反轉錄病毒載體。5-FU enriched小鼠造血先驅細胞將藉反轉錄病毒選殖出單獨的突變型，或加上MLL-AF10 之協同突變，以經轉殖不朽化的白血病細胞株，注射到經次致死量放射照射的同種小鼠，以研究致白血病機轉。預期成果和重要性：研究結果將提供有關EVI1、BAALC、FHIT 和ERG 基因表現在AML MLL-R 亞型，及其次亞型MLL-PTD 和MLL/t11q23 之間的差異。此結果將與我們以前的基因突變資料結合，可更明瞭對於EVI1、BAALC、FHIT 和ERG 基因在MLL-PTD 和MLL/t11q23 AML之致白血病機轉。以SNP 微陣列晶片作分子對偶基因核型分析，我們預期可發現MLL-PTD 病人的基因體異常樣式，並找出將來應對那些基因作更深入的研究。完成以小鼠模式對協同基因突變致白血病機轉的研究，我們將能釐清MLL-AF10 單獨或有協同基因突變時，其引起白血病之潛伏期和表現型。這將是對AMLMLL-AF10 亞型與c-FMS(Asn572Thr)協同致病機轉研究的一個突破。

系統編號:PC9902-0299
原計畫編號:NSC97-2314-B182-011-MY3