以比較雜交微陣列分析MTAP基因剔除於黏液肉瘤之頻率、預後、生物及輻射效應之意涵---評估以L-Alanosine做為輻射增敏劑之可能

黏液纖維肉瘤及伴隨黏液變化之脂肪肉瘤是常見具黏液型態的軟組織肉瘤。脂肪肉 瘤包含分化良好和去分化型、黏液型及圓細胞型，及多形性等三大類型皆可產生黏液變 化。此等肉瘤在組織病理上很相似，但腫瘤行為有相當之差異，因此造成診斷和預後的 困難。雖然分化良好型與黏液型脂肪肉瘤皆具有特異性的致癌基因，然而目前對它們如 何進展成為高度惡性形態的分子生物機轉所知有限。同樣地，對於不具特異性致癌基因 的黏液纖維肉瘤及多形性脂肪肉瘤，其腫瘤之生成機轉依然未知，有待進一步釐清。 利用高解析微陣列比較基因雜交技術(aCGH)能探究細微染色體區間增幅或缺失的 變化，因而具有尋找致癌基因或腫瘤抑制基因變化的優勢。以此技術，我們在前驅的12 個黏液纖維肉瘤檢體及2 株黏液纖維肉瘤細胞株(OH931 及NMFH-1)進行全基因DNA 分析，發現第九染色體短臂有四個主要區段有基因剔除現象，此區段在一般上皮癌亦常 有類似剔除且包含不少可能的抑癌基因。於此區段內可能之候選抑癌基因中，位於 9p21.3 之抑癌基因MTAP 常於腫瘤中出現DNA 剔除現象並常與二種較為人知的抑癌基 因﹝也就是：p16INK4a and p15INK4b﹞一併產生全合子剔除。MTAP 基因之轉譯酵素蛋白- 甲基硫腺苷酸磷酸酶-為蛋氨酸與腺嘌呤救援路徑之必需物。為確認aCGH 之可信度， 我們已利用定量RT-PCR 與西方點漬法分別證實2 株黏液纖維肉瘤細胞株皆有該基因之 完全或部分缺失: OH931 為全合子剔除而NMFH-1 為半合子剔除。值得注意的，利用 免疫染色分析，我們同時也注意到部分黏液纖維肉瘤與不同型態的脂肪肉瘤皆具有 MTAP 蛋白缺乏。近來，MTAP 基因已經被認定為腫瘤抑制基因。除了基因剔除外，基 因啟動區的過度甲基化也可能是此一類基因去活化的機轉之一，而不同的去活化機轉之 間因具不同病理意義而可能造成不同型態腫瘤之分化度與侵襲性。我們提出之假說是 MTAP 蛋白質缺乏導因於其基因及/或上基因之缺失及/或抑制，此類去活化促使具黏液 肉瘤之生成。值得注意的是，MTAP 缺乏之腫瘤較可能被AMP 重新合成抑制劑所影響 而造成腫瘤細胞死亡，此意味著偵測MTAP 基因狀態在治療上具有潛在應用價值。 在此三年計畫，我們將以相關實驗來證實下述目標：(A)以aCGH 分析多種黏液組 織肉瘤之基因增幅或缺失，並特別著眼9p21.3 之MTAP 基因。(B)利用組織微矩陣技術 以及免疫組織染色、原位雜交法分別分析黏液纖維肉瘤及各類脂肪肉瘤檢體之MTAP 的蛋白表現及其轉錄狀況，其結果將與臨床病理特徵做分析。(C)以雷射擷取儀取得高 純度肉瘤細胞，合併即時定量PCR 與反轉錄PCR 測定MTAP 之DNA 含量與mRNA 表 現量。(D)利用對甲基化專一之PCR 釐清黏液肉瘤樣本中缺乏蛋白表現但無全合子基因 剔除者，其是否經由MTAP 基因啟動子之過度甲基化狀況而影響MTAP 表現。(E) 將 MTAP 基因為全合子剔除之OH931 細胞轉殖入帶MTAP cDNA 之質體並對半合子剔除 之NMFH-1 細胞株去甲基化，藉此分析其對ornithine decarboxylase 之調節及多種細胞 癌化過程之影響。(F)將MTAP 專一之shRNA 殖入未變性之纖維母細胞以去除其內生 MTAP，藉此評估MTAP 缺失對腫瘤生成之結果。(G) 利用L-alanosine 治療MTAP 缺乏 之黏液肉瘤細胞，評估此藥之抗癌效果及其藥理機轉。(H) 黏液肉瘤經以上述各種方式 處理後接受游離輻射照射，探討MTAP 在調節輻射反應所扮演之角色。(I) 將上述(H) 之肉瘤細胞於輻射照射前給予L-alanosine，探討此以MTAP 為標靶之藥物是否為一具潛 力之輻射增敏劑。我們預期這些發現將對黏液肉瘤之細胞病理提供重要訊息，並有助於 進一步找出其新的生物預後因子以及治療標的。

系統編號:PC9902-1659
原計畫編號:NSC98-2314-B182-035-MY3