多巴胺自身受體的分子作用機制及下游訊息路徑調控動物活動能力的探討

本計畫主要的重點在於研究參與動物活性的多巴胺第二亞型類受體的細胞訊息，以及多巴胺第二亞型類受體對位於軸突末稍傳遞子（dopamine transporter）的可能調控機轉，此外有鑑於第三亞型受體在邊緣區內和神經生長因子BDNF 的受體trkB 通常表現在一起並影響情緒功能，所以我們將同時探討是否這兩者受體間存在訊息的交互作用；這些次細胞層級和行為的分析，將可以讓我們瞭解到目前能不清楚的多巴胺第二亞型受體，竟就利用何種細胞內訊息來驅動動物的活動能力？這項研究結果將對若干中樞多巴胺病變提供可能的嶄新藥物研發方向，因為傳統上對抗精神分裂症或帕金森氏症均以第二亞型受體製劑為主，而第二亞型受體的下游調控路徑一直以來並未被探知，若經由本實驗透過各種離體細胞與動物模式驗證特殊的第二亞型受體訊息可以調控動物活動力，則可以提供另類的藥物調控方式，或可避免傳統第二亞型類藥物所產生的副作用。此外，本實驗室先前有發現血清素自身受體5-HT1a 可以在基因轉殖的細胞株上，藉由調控血清素傳遞子而抑制對血清素的回收作用，這嶄新的研究結果過去從未被報導過，代表同時位於神經末稍可調控傳導物質釋放的兩種主要蛋白：自身受體與傳遞子間可能存在某種未知的調控機轉，深值進一步的研究，所以我們將各類第二亞型與第三亞型受體轉殖於特定細胞株上，藉以研究細胞內的訊號調控機轉。針對以上這些研究的起因，我們將以以下的各項實驗操作方式一一解答：（一）我們將利用本實驗室已建立起的多巴胺第二類亞型受體（分為D2L 、D2S 和D3）表現細胞株研究對外加的[3H]DA作釋放調控的實驗，這將包括測試可能的Cdk5/DARPP-32、Akt/GSK3 和MAPK 訊號對經由自身受體抑制多巴胺釋放的影響，我們將採用一系列的生化分生與影像分析方式作研討。（二）本實驗將利用雙重轉殖的方式將特定的第二類亞型受體分別與多巴胺傳遞子大量表現於神經細胞內，並利用外加的[3H]DA 從事有關細胞回收的實驗，一旦建立起關連，我們將進一步利用藥物或siRNA 的方式測試何種細胞內訊息可以透過自身受體以影響傳遞子的運作，我們並將以二維蛋白電泳分析傳遞子本身的磷酸化位置，已確認可能的上游磷酸酵素。此外，我們並將合併轉殖第三亞型受體與trkB 受體，在特定的細胞株內研究兩者的可能訊號交互作用，包括經由trkB 誘發的Akt/GSK3 和MAPK 是否可能由第三亞型受體操控，藉以瞭解只表現於邊緣區的第三亞型受體如何藉由trkB 影響神經活性。（三）經由前兩項實驗若獲得特定的第二亞型類受體訊息，則我們將進一步驗證於活體腦組織，並以活動性行為評估該訊號的影響程度，這將是關鍵的實驗項目，因為往往離體表現的細胞訊號無法重現於活體內。我們將利用腦局部注射的方式或體注射將第二亞型類受體製劑帶入腦區以誘發動物的活動性，然後測試特定腦區訊號的變化，並與誘發的行為作關連，以確定活體腦部第二亞型類受體如何參與生理功能。（四）如果上述實驗確實可以在活體組織上重現，則我們將利用藥物或是siRNA 阻斷或是活化特定腦區的特定訊息，再以行為分析作為指標，將可以釐清第二亞型類受體所在的神經迴路如何參與動物的活動性，以及如何利用阻斷該訊息以影響動物的活動性。（五）經由以上離體的機制探討和活體的生理功能關連，我們將獲得第二亞型類受體活化行為的特定訊號，因此我們最後將測試於腦病變的動物模式上，希望藉由各種多巴胺相關的疾病模式，測試若操控第二類受體亞型下游訊息是否可以達到治療的目的。本實驗因此將採用本實驗室已建立起的帕金森氏症、甲基安非他命成癮以及精神分裂症的動物模式，並利用前項實驗結果驗證特定訊息對疾病的逆轉程度，以供未來新藥研發的基礎。我們期望經由這一系列相關的離體與活體實驗可以建立起多巴胺第二亞型類受體（包括D2S、D2L 和D3）對動物活動力的影響，並對細胞內訊息機制以及調控傳遞子（DAT）或是耦合trkB 的分子作用機轉提供有力的證據；有效的將基礎研究的成果轉化為未來臨床醫療的應用。

系統編號:PC9508-1885
原計畫編號:NSC95-2320-B182-048-MY2