使用新型胜肽核酸鉗夾定量聚合酶連鎖反應法來定量乙肝病毒共價閉合環狀DNA

乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染估計發生於全世界2.4億名患者。在台灣，1986年以前出生的人（＞ 31歲），帶原率保持在15％左右。而於1986年以後出生的人，由於普遍接種疫苗，流行率逐漸下降到 ＜1％。目前的抗乙肝治療能夠持續抑制乙肝病毒複製到無法檢測到的水平。下一代抗乙肝藥物的治療目標則是完全消除乙肝病毒，即消除組織共價閉合環狀DNA (cccDNA)。目前量化cccDNA的方法仍然相當笨拙。傳統的cccDNA定量PCR方法依賴於差異性之PCR效率，其中使用具有cccDNA“特異性”的PCR引物乃橫跨於HBV rcDNA的基因鍊缺口兩側。但由於PCR過程中核苷酸序列可跳躍，所以當HBV rcDNA濃度較高時，仍可產生rcDNA相關PCR產物。因此，據估計，cccDNA和rcDNA之間的有效區分只能發生在介於0至10（3）個基因數間或更窄。當總HBV DNA濃度高時，必須進行大量稀釋，以使樣品的濃度能夠進入有效範圍。但是，經過大量稀釋後，原本低濃度的cccDNA就檢測不到。因此，不同樣本中cccDNA濃度的公平比較變得不可能。為了實現公平的比較，特別是在開發下一代抗HBV藥物時，我們迫切需要一種有更寬有效範圍以量化cccDNA的qPCR方法。在這個計畫中，我們設計了一種使用基於胜肽核酸（PNA）鉗夾的qPCR新方法。 PNA鉗夾可用於抑制rcDNA的擴增，而cccDNA因為不能被“鉗夾”而可被擴增。我們檢查了擴增rcDNA和cccDNA的差異效率。初步數據表明，沒有預稀釋的樣品可以實現0到10（5）基因數的有效檢測範圍。 這個計劃的目的是：第一年、確定PNA鉗夾qPCR方法來檢測組織cccDNA的靈敏度和特異性。初步數據顯示，我們已經可以將有效範圍擴大到0 - 10（5）基因數。本計畫將嘗試進一步優化此方法。第二年、使用配對的肝癌組織（癌性和非癌性部分）定量肝內cccDNA，並將cccDNA水平與其他臨床病理因素以及術後存活率相關聯。我們的初步數據顯示，cccDNA水平（非癌性部位）與術後存活率以及遠處轉移相關。 第三年、我們已經收集了使用用恩替卡韋治療但仍發生肝癌的患者的4對肝癌組織。我們的初步數據顯示，其中1例患者cccDNA仍存留在非癌組織中，次代定序顯示cccDNA和mRNA中致癌性S截斷突變點有不同分佈。我們將完成所有4對肝癌組織的次代定序。

系統編號:PC10901-0310
原計畫編號:MOST107-2314-B182-004-MY3