心臟麻痺液灌注引發心肌細胞缺氧再灌注傷害時，微型核醣核酸調控內質體壓力反應的可能機轉

背景：越來越多的證據顯示，內質體壓力反應所產生的蛋白質包裹不良是許多血管及心臟及病的病因之一。當細胞面對外在環境的壓力時，蛋白質的生產及包裹過程就受到影響，間接的造成細胞及器官的傷害。這些不良的蛋白質累積在內質體中，會影發三個重要的蛋白質的活化，包含了PERL，IRE-1，及ATF6，目前認為這三種蛋白質是內質體壓力反應過程中最重要的三個反應介質。對於如何減少心臟手術中，使用心臟麻痺液保護心臟時，所造成的心肌缺血再灌注傷害，一直是心臟外科重要的研究課題。在這些情況下，某些細胞質的傳遞訊號被活化；且這些傳遞訊號被認定為人工體外循環後，影響心肌功能的主要原因。微型核糖核酸在各型細胞調控的角色越來越重要的現在，我們希望藉由本計劃的實驗設計來研究，微型核糖核酸可以影響內質體壓力反應進而調控細胞凋亡的產生，及微型核糖核酸經由哪些傳導路徑達成此一功能，。細胞凋亡，即計劃性的細胞死亡，發生於心肌病變，心臟移植後的慢性排斥，及冠狀動脈氣球擴張術後的血管內膜增生。但微型核糖核酸與內質體壓力反應所造成的心肌細胞凋亡之間的關係，在使用心臟麻痺液保護心臟時，從未被釐清。因此本實驗設計特別著眼於心臟麻痺液所造成的心肌缺氧與再灌注傷害的模式之下，微型核糖核酸對於心肌細胞凋亡的影響。一、目的：本研究計畫的中心目的是研究，微型核糖核酸所提供的心臟調控機制，在開心手術時，是否是經由細胞中活化或抑制特定蛋白的表現所達成。二、方法：1. 本研究計劃為三年計劃。第一年以大鼠（每組10隻，共50隻）為實驗動物。連續注射阻抗微型核糖核酸(30c,96,3534-3p)三天後，於第四天在麻醉下，以離體心臟灌流系統做後續的實驗。在整個實驗過程中密切紀錄血行動力學的變化，並持續至整個實驗結束。開始循環後60分鐘，將主動脈灌流停住改為，每20分鐘灌注冷晶性(4°C)心臟麻痺液，持續60分鐘。之後恢復一般灌流4小時。實驗中將在下列時間點，自灌流系統抽取檢體：開始後，體外循環開始10分鐘後，脫離體外循環後及體外循環結束4小時後，將心臟取下，切下心肌，以微型核糖核酸陣列分析核醣核酸，西方墨點法分析蛋白質體表現，及其他實驗。2. 第二年以大鼠（每組10隻，共50隻）為實驗動物。先以冠狀動脈結紮術造成心肌梗塞並引起鬱血性心臟衰竭的動物模型(此動物模式有50%的死亡率，因此共需100隻實驗動物)。心臟衰竭模型建立四週後連續注射阻抗微型核糖核酸(30c,96,3534-3p)三天，於第四天取下心臟。在麻醉下，以離體心臟灌流系統做後續的實驗。開始循環後60分鐘，將主動脈灌流停住改為，每20分鐘灌注冷晶性(4°C)心臟麻痺液，持續60分鐘。之後恢復一般灌流4小時。實驗中將在下列時間點，自灌流系統抽取檢體：開始後，體外循環開始10分鐘後，脫離體外循環後及體外循環結束4小時後，將心臟取下，切下心肌，以微型核糖核酸陣列分析核醣核酸，西方墨點法分析蛋白質體表現，及其他實驗。3. 第三年依前二年的的實驗後成果，將H9c2心肌細胞分組在缺氧艙(hypoxic chamber)中，至細胞模式進行進一步利用抗訊息核醣核酸(siRNA)來分析細胞內後續的訊息傳遞。缺氧-再灌注實驗後將進行下列檢測：A. Flow cytometry analysis for apoptosis，B. miRNAs arrayC. Detect mRNAs expression pattern (qRT-PCR)D. TUNEL methodE. Western blot to check protein expressionF. ELISA to check cardiomyocytic damage (cTnI, caspases activities, )四、假說：我們預期由本研究計畫可證實下列假說：1. 經由體外循環下灌注心臟麻痺液會經由內質體壓力反應造成細胞凋亡，此一現象在冠狀動脈結紮後的鬱血性心臟衰竭動物模型下更為明顯。2. 調控微型核糖核酸可影響心臟麻痺液缺氧再灌注所造成的心肌細胞凋亡。3. 微型核糖核酸所影響體外循環造成的心肌細胞傷害，是經由許多蛋白質的活化或抑制所達成的。4. 利用體外細胞膜式可以證明，調控微型核糖核酸可調整內質體壓力反應後所產生的缺氧再灌注傷害。5. 給予微型核糖核酸及其拮抗微型核糖核酸，會減緩心肌細胞凋亡的傷害。五、預期效果重要性：本研究計畫之主要目標在探討，體外循環所造成心臟的缺血-再灌注傷害，微型核糖核酸在心肌細胞內，是否經由調控內質體的作用達成影響心肌細胞的凋亡。並研究調控微型核糖核酸，是否對於心肌梗塞後的心臟衰竭治療，對改善體外循環所造成的心臟缺血-再灌注細胞凋亡傷害的可能性，以期增進對心臟的保護。我們預期由此研究計畫所得到的知識，可澄清體外循環所造成心臟的缺血-再灌注傷害的病生理學，並可作為我們改善或預防開心手術施行體外循環時，所造成的所造成心臟缺血-再灌注傷害。我們希望藉此提昇開心手術時對心臟的保護，減少開心手術後心臟衰竭的機會，進而增加病患存活的機會。

系統編號:PC10108-0911
原計畫編號:NSC101-2314-B182A-137-MY3