探討石斑木成份藉由PI3K調控發炎免疫反應機轉及其動物肝臟缺血性再灌流傷害之研究

在此計劃的研究中，我們針對石斑木（Rhaphiolepisindica）的萃取物對於調控人類嗜中性白血球自由基釋放以及水解酶釋放的機轉進行探討，由於石斑木成分調控白血球自由基的機轉非常特殊，有抑制作用，也有促進的作用，因此藉由對石斑木天然物的機轉研究，也讓我們對人類嗜中性白血球本身調控自由基的機轉更深入的研究。 實驗中我們發現 5-Hydroxy-2-(4-Hydroxy-3-Methoxyphenyl)-3,7-Dimethoxy-4H-Chromen-4-one代號為MSF-2隨著濃度的變化抑制 fMLP 所引起的自由基跟水解酶釋放，MSF-2 抑制兩者的 IC50 分別為 22.8±4.8 and 14.2±1.7 μM。但再進一步的研究顯示，MSF-2 對活化 PKC 途徑的刺激劑 PMA 所引起的自由基跟水解酶的釋放並沒有影響。在接下來的研究中，我們發現 MSF-2 只對 fMLP 所引起細胞內 AKT蛋白質的磷酸化（活化）有明顯的抑制，對 fMLP 所引起的 erk、p38 都沒有影響。相同的，對 PMA 所活化的 ERK, Akt 以及 p38 都沒效果。實驗的結果顯示，MSF-2 對AKT 上游的蛋白質，包括 PDK1 也有抑制的的效果，顯示 MSF-2 對 AKT 途徑的專一性，因此我們針對影響 AKT 的 PI3K 進行瞭解，在初步的研究中，我們發現 MSF-2的確會抑制 PI3K 這個酵素，這是一個非常特殊的藥品，現今最常用的 PI3K 抑制劑為 wortmannin，MSF-2 是否也有此效果，我們在接下來的研究中，將針對MSF-2 對那些亞型的 PI3K 有專一性的抑制。在此過程中，我們利用螢光蛋白質結合的實驗，以流式細胞儀排除 MSF-2 可能是 fMLP 受體的拮抗劑。在自由基釋放的過程中，細胞內鈣離子的改變是 fMLP 引起活化很重要的過程，我們的實驗也顯示 MSF-2 對fMLP 所引起的鈣離子內流也很明顯的抑制。而藥物對 PI3K 的抑制也連帶對PLCγ2的作用，而對 PLCγ2 的抑制也印證 MSF-2 抑制 fMLP 所引起的鈣離子內流增加。MSF-2 在接下來的研究中，將如我們所說，瞭解對那種亞型的 PI3K 的抑制，以及和現行 PI3K 抑制劑的差異，以及對嗜中性白血球趨化性的影響，最後在動物體內對於肝臟缺血性再灌流的影響。白血球除了發炎，還參與許多病理狀態，其中迫切要解決的問題之一就是缺血後再灌流；血液再灌流往往對組織有明顯的傷害，而這些傷害已經被證實和嗜中性白血球有密切的關連，因此我們利用將小鼠肝門靜脈以手術夾造成缺血，接著讓血液再流通造成再灌流的肝臟細胞損傷，我們已經成功的完成動物模式的建立與評估，初步結果顯示於再灌流前投與MSF-2 也有減少肝臟損傷的區域的情形，分析血液中alaninetransaminase（ALT）也顯示有改善肝臟功能，因此接下來的研究重點，將評估石斑木成份對於再灌流所造成的肝損傷的治療程度，並且分析石斑木成份在這個模式中的作用模式與機轉，對於將來石斑木成份的開發將有明顯的助益其次， 對於石斑木另一類成分 2-(1'-geranyloxy)-4,6-dihydroxyacetophenone（MSF-4），MSF-4的作用完全相反，MSF-4促進嗜中性白血球的活化，能促進自由基的釋放以及cathepsinG的產生，活化的濃度在30μM達到做大的效果，在初步的研究顯示，MSF-4引起白血球的活化可能是藉由活化PLD、PKC以及細胞內鈣離子的變化，而一般所瞭解erk、p38 以及AKT等等都沒有參與，但有趣的是MSF-4能活化erk、p38、AKT，這是我們想要瞭解的，為何活化erk、p38、AKT但卻沒有參與其產生自由基的過程？以及MSF-4如何活化PLD以及PLD和PKC、鈣離子彼此之間的調節效果？MSF-4的活化白血球的現象則有助於白血球功能低下的人，目前我們也將進行MSF-4 在動物體內是否會成發炎的現象？

系統編號:PC10108-0823
原計畫編號:NSC101-2320-B182-019-MY3